Térben és gyorsan: hogyan lát bele egy mikroszkóp az élő agyszövetbe?

Tartsunk egy zseblámpát az ujjbegyünk mögé egy sötét szobában: az ujjunk vörösen izzik. A fény tehát átjut a szöveten – csak éppen össze-vissza szóródva, ezért éles képet nem látunk rajta keresztül. Ez a kísérlet foglalja össze a biológiai képalkotás egyik legnagyobb nehézségét. Az élő szövet nem átlátszó üveg, hanem fényszóró közeg, mint a köd. Aki egy agysejt finom nyúlványait akarja látni, mégpedig működés közben, annak ezen a ködön kell átlátnia – lehetőleg térben, és olyan gyorsan, ahogy az idegsejtek jeleznek.

Az első lépés: csak a fókuszból jövő fényt fogadjuk el

A hagyományos fluoreszcens mikroszkópban a megvilágítás a minta teljes vastagságában gerjeszti a festékmolekulákat. A kamera így az élesre állított sík fényét a fölötte és alatta lévő rétegek elmosódott fényével együtt látja.

A konfokális mikroszkóp erre egy egyszerű, de zseniális választ ad: a detektor elé egy apró nyílást, tűlyukat tesz, amely pontosan a fókuszpont képénél helyezkedik el. A fókuszból érkező fény átjut rajta, a máshonnan jövő, életlen fény viszont nagyrészt fennakad. Így a mikroszkóp egyetlen vékony síkot „metsz ki” optikailag a mintából. Az elvet Marvin Minsky dolgozta ki; szabadalmi bejelentését 1957-ben nyújtotta be, és 1961-ben kapta meg.

A konfokális képhez a mintát pontról pontra kell végigpásztázni, és van egy hátránya is: a gerjesztő fény a fókuszon kívül is gerjeszti a festéket, ami fölösleges kifakulással és a sejtek terhelésével jár, a látható fény pedig a szövetben erősen szóródik.

A második lépés: két foton egyszerre

1990-ben Winfried Denk, James Strickler és Watt Webb a Cornell Egyetemen a Science folyóiratban írta le a kétfoton-gerjesztéses lézerpásztázó mikroszkópot. Az ötlet a kvantumfizikából jön. Egy festékmolekulát egyetlen, nagy energiájú foton gerjeszthet – de gerjesztheti két, fele akkora energiájú foton is, ha szinte pontosan egyszerre érkeznek. A fél energia nagyjából kétszeres hullámhosszt jelent, vagyis a látható fény helyett közeli infravörös fényt.

Két foton egyidejű elnyelése nagyon valószínűtlen esemény, és a valószínűsége a fényintenzitás négyzetével arányos. Ennek két következménye van:

1. Csak ott történik érdemi gerjesztés, ahol a fény a legjobban összesűrűsödik: a fókuszpontban. A tűlyukra nincs is szükség, mert a fókuszon kívül eleve nem keletkezik fluoreszcencia, és kifakulás is csak a fókusz közelében lép fel.
2. A szükséges csúcsintenzitáshoz rendkívül rövid, egy pikoszekundumnál rövidebb impulzusokban sugárzó lézerek kellenek, amelyek az átlagteljesítményt alacsonyan tartják.

A közeli infravörös fény ráadásul kevésbé szóródik a szövetben, mint a látható – erre emlékeztet a vörösen izzó ujjbegy is. Ezért lát a kétfoton-mikroszkóp mélyebbre az élő agyszövetben.

A harmadik lépés: a sebesség

Itt jön a nehezebb rész. A kétfoton-mikroszkóp is pontról pontra pásztáz. A lézersugarat hagyományosan két kis tükör téríti el, amelyeket motorok forgatnak. Egy tükörnek azonban tömege van, a tehetetlensége miatt nem tud tetszőleges pontra azonnal ugrani. Ha pedig a mintát térben akarjuk feltérképezni, a fókuszt mélységben is el kell tolni, például az objektív mozgatásával – ez még lassabb.

Az idegsejtek elektromos jelei viszont ezredmásodpercek alatt zajlanak le. Ha a mikroszkóp egy háromdimenziós térfogatot síkról síkra jár be, mire visszaér egy sejthez, az esemény rég lezajlott. A kérdés tehát az: hogyan lehet a fókuszt mechanikai mozgás nélkül, gyorsan, tetszőleges térbeli pontra ugratni?

Hanggal terelt fény: az akuszto-optika

A válasz az akuszto-optikai eltérítő. Ez egy átlátszó kristály, amelybe egy rezgő elem nagyfrekvenciás hanghullámot vezet. A hanghullám sűrűsödései és ritkulásai a kristály törésmutatóját periodikusan változtatják, így a kristályban egy „hangból készült” optikai rács jön létre. A rajta áthaladó lézersugár elhajlik, és az elhajlás szöge a hang frekvenciájától függ. Ha a frekvenciát változtatjuk, a sugár iránya is megváltozik – mozgó alkatrész nélkül, nagyon rövid idő alatt.

A trükk folytatása még szebb. Ha a kristályban a hang frekvenciája a kristály mentén folyamatosan változik, a rács egyik végén sűrűbb, a másikon ritkább lesz. Az ilyen rács nemcsak eltérít, hanem lencseként gyűjt vagy szór is. Több ilyen kristályt megfelelően összehangolva a fókusz nemcsak oldalirányban, hanem mélységben is mozgatható. Így születik a háromdimenziós, „véletlen hozzáférésű” pásztázás: a mikroszkóp csak azokat a pontokat látogatja meg, amelyek érdekesek, a köztük lévő üres teret átugorja.

A magyar hozzájárulás

Ezen a területen magyar kutatók meghatározó eredményeket értek el. Rózsa Balázs csoportja – ma a HUN-REN Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetben (KOKI) – Katona Gergellyel és munkatársaikkal 2012-ben a Nature Methods folyóiratban mutatott be egy akuszto-optikai kétfoton-mikroszkópot, amelynek pásztázási térfogata megközelítette a köbmillimétert. Agyszeleteken ezredmásodpercnél pontosabb időfelbontással követték, hogyan terjednek a jelek a nyúlványokon, élő egér látókérgében pedig több száz idegsejt aktivitását rögzítették egyszerre.

A következő nagy lépést egy 2016-ban a Neuron folyóiratban megjelent tanulmány jelentette. Ebben a csoport megoldotta, hogy a mérés mozgó, viselkedő állatban is használható maradjon: az egyes mérési pontokat apró térbeli vonalakká, felületekké vagy kis térfogatokká „nyújtották”, így az agyszövet elmozdulása nem viszi ki a célpontot a mérésből. A szerzők több mint 150 dendrittüske, illetve több mint 100 sejttest gyors, egyidejű térbeli mérését mutatták be.

A kutatásból vállalkozás is lett: Rózsa Balázs és Katona Gergely 2005-ben alapította meg a Femtonics nevű céget, amely a KOKI elődintézetéből kivált első ilyen vállalkozásként kétfoton-mikroszkópokat fejleszt és értékesít a nemzetközi kutatási piacon.

Elsőség és arányok

Érdemes pontosnak lenni. Sem a konfokális, sem a kétfoton-mikroszkópia nem magyar találmány, és akuszto-optikai pásztázó mikroszkópokat más kutatócsoportok is fejlesztettek – például a londoni University College London kutatói, akik szintén 2016-ban közöltek ébren lévő, viselkedő állatokban végzett háromdimenziós, véletlen hozzáférésű mérést. A magyar csapat érdeme a gyors, nagy térfogatú háromdimenziós akuszto-optikai pásztázás kidolgozása és gyakorlatba vitele – ez nemzetközileg is elismert, de egy élénk, versengő kutatási terület része.

Kísérlet otthon: Töltsünk meg egy átlátszó poharat vízzel, és csepegtessünk bele néhány csepp tejet. Világítsunk át rajta oldalról egy zseblámpával egy sötét szobában. A fénynyaláb útja jól látszik, és a pohár túloldalán a fényfolt elmosódott. Minél több tejet adunk hozzá, annál kevésbé látunk át rajta – pontosan ez a szóródás az, amellyel az agyi képalkotásnak meg kell küzdenie.

Mi lett belőle?

A gyors háromdimenziós kétfoton-mikroszkópia sikeres kutatási eszköz és kereskedelmi termék lett. Nem gyógyító vagy diagnosztikai berendezés, hanem alapkutatási műszer: arra szolgál, hogy a kutatók megfigyelhessék, hogyan dolgoznak együtt az idegsejtek egy élő hálózatban. A fejlődés iránya a még nagyobb térfogat, a még nagyobb mélység és a még gyorsabb mérés – és ebben a versenyben a budapesti műhely továbbra is jelen van.